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Título: Metodologias analíticas para determinação do perfil químico, atividade imunomoduladora e citotóxica do látex de Euphorbia tirucalli L
Autor(es): Souza, Larissa Silva de
Orientador: Kuster, Ricardo Machado
Coorientador: Filgueiras, Paulo Roberto
Data do documento: 14-Fev-2019
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: Euphorbia tirucalli L. é amplamente utilizada pela medicina popular brasileira, principalmente por sua atividade anticancerígena. No entanto, sua comercialização foi proibida pela ANVISA devido à presença de alguns compostos considerados tóxicos, como os ésteres diterpênicos. Logo, o presente estudo caracterizou o látex dessa planta por diferentes métodos analíticos como também analisou sua atividade imunomoduladora e citotóxica. O látex foi coletado por dois procedimentos, em solução de diclorometano: metanol (3:1,100 mL) e em 100 mL de água destilada. O primeiro foi concentrado como um extrato bruto e o segundo foi particionado com hexano e diclorometano. As partições e o extrato bruto foram submetidos à análises fitoquímicas utilizando três métodos distintos: espectrometria de massas, técnicas FT-ICR MS (ESI (-) e APCI (+)), cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN de 1H, RMN 13C, COSY, HSQC e HMBC). O potencial citotóxico foi avaliado utilizando-se o extrato bruto sobre macrófagos RAW 264.7 e sobre células cancerosas gástricas AGS. A avaliação da atividade imunomoduladora foi feita através da avaliação da produção de óxido nítrico e citocinas como TNF-α e IL-6 por macrófagos. A técnica CG-EM mostrou a presença de alguns ésteres de ácidos graxos, como o mirístico, palmítico, esteárico, oleico e linoleico e, principalmente, triterpenos como euphol e tirucallol. Por RMN, a maioria dos sinais foi relacionada aos triterpenóides euphol e tirucallol. No entanto, quando o látex foi analisado por ESI (-) FT-ICR MS, foi encontrada uma grande variedade de moléculas de diferentes classes de produtos naturais (ácidos graxos, diterpenos, triterpenos, esteróides). Por APCI (+) FT-ICR MS, o íon em m/z 426,38, relacionado à massa dos triterpenos euphol e tirucallol foi o pico mais intenso, com erro de massa -0,11, indicando alta precisão. Os ésteres diterpênicos de núcleo 4-deoxyphorbol e ingenol foram identificados apenas por ESI (-) FT-ICR MS e por ESI (-) FT-ICR MS/MS. Quando avaliado biologicamente, o látex bruto apresentou atividade imunomoduladora, pois reduziu a produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6 e NO, e o efeito na redução do NO foi mais expressivo, obtendo resultados semelhantes ao padrão L-NAME, bem como atividade citotóxica significativa (IC50 = 69,43 ± 1,29 μg/mL) contra células de adenocarcinoma gástrico (AGS) sem danificar células saudáveis. Assim, verificou-se que o látex da Euphorbia tirucalli consiste principalmente dos triterpenos euphol e tirucallol, que podem ser os principais responsáveis pela atividade antineoplásica atribuída à planta, mas muitos outros compostos menoritários podem ser determinados por FT-ICR MS, como os ésteres diterpênicos. Possui potencial antitumoral, pois age seletivamente contra células cancerosas e ainda impede a progressão do tumor, pois possui importante efeito imunomodulador.
Euphorbia tirucalliL. is widely used by Brazilian popular medicine, mainly for its anticancer activity. However, its commercialization was banned by ANVISA due to the presence of some compounds considered toxic, such as diterpene esters. Therefore, the present study characterized the latex of this plant by different analytical methods as well as analyzed its immunomodulatory and cytotoxic activity. The latex was collected by two procedures in dichloromethane: methanol solution (3: 1, 100 mL) and in 100 mL of distilled water.The former was concentrated as a crude extract and the second was partitioned with hexane and dichloromethane. Partitions and crude extract were subjected to phytochemical analysis using three different methods: FT-ICR MS (ESI (-) and APCI (+)), GC-MS andNMR (1H-NMR, 13C NMR, COSY, HSQC and HMBC). The cytotoxic potential was evaluated using the crude extract in RAW 264.7 and AGS macrophages. The evaluation of immunomodulatory activity was made through the detection of nitric oxide and cytokines such as TNF-αand IL-6. The CG-MS technique showed the presence of some esters of fatty acids, such as myristic, palmitic, stearic, oleic and linoleic and, mainly, triterpenes such as euphol and tirucallol. By NMR, most of the signals were related to the triterpenoids euphol and tirucallol. However, when the latex was analyzed by ESI (-) FT-ICR MS, a large variety of molecules of different classes of natural products (fatty acids, diterpenes, triterpenes, steroids) were found. By APCI (+) FT-ICR MS, the ion in m/z426,38, related to the mass of the euphol and tirucallol triterpenes, was the most intense peak, with mass error -0.11, indicating high precision. The diterpene esters of 4-deoxyphorbol and ingenol were identified only by ESI (-) FT-ICR MS and by ESI (-) FT-ICR MS/MS. When biologically evaluated, the crude latex showed immunomodulatory activity, since it reduced the production of proinflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and NO, and the effect on NO reduction was more expressive, obtaining results similar to the standard L-NAME, as well as significant cytotoxic activity (IC50=69.43 ± 1.29 μg/mL) against gastric adenocarcinoma cells (AGS) without damaging healthy cells. Thus, it was found that Euphorbia tirucalli latex consists mainly of the triterpenes euphol and tirucallol, which may be the main responsible for the antineoplastic activity attributed to the plant, but many other smaller compounds can be determined by FT-ICR MS, such as diterpene esters . It has antitumor potential, as it acts selectively against cancerous cells and still prevents the progression of the tumor, since it has an important immunomodulatory effect.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10785
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