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Título: Produção de enzimas α-amilase por Aspergillus niger em fermentação no estado sólido utilizando bagaço de malte de cevada
Título(s) alternativo(s): Produção de enzimas alfa-amilase por Aspergillus niger em fermentação no estado sólido utilizando bagaço de malte de cevada.
Production of the α-amylase enzyme by Aspergillus niger in solid-state fermentation using brewer’s spent grain
Autor(es): Lima, Renan Carlos Freitas de
Orientador: Pinheiro, Iara Rebouças
Data do documento: 11-Fev-2019
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: O reaproveitamento de resíduos agroindustriais vem ganhando destaque nas pesquisas relacionadas à fermentação em estado sólido (FES). São fontes de substrato com baixo custo de aquisição e destinam tais resíduos para destinos com mais valores agregados. A FES, por sua vez, vem ganhando destaque no cenário de pesquisas acadêmicas como um desafio de redução de custos para produção de produtos com alto valor agregado, como por exemplo as enzimas. A modelagem matemática do crescimento celular é uma ferramenta para o auxílio da ampliação de escala desse tipo de fermentação, uma vez que consegue-se predizer o crescimento da biomassa no meio fermentativo, pode-se automatizar e controlar parâmetros que interferem negativamente nas FES. Objetivos: Realizar a fermentação em estado sólido do fungo Aspergillus niger com resíduo de bagaço de malte, da indústria cervejeira; Otimização por superfície de resposta e modelo estatístico das condições de cultivo e validação do modelo; Realização da cinética de atividade enzimática α-amilase na condição ótima de produção; Realização da cinética de hidrólise da conversão amido → glicose, pelo extrato enzimático; Fermentação em coluna de Raimbault para avaliação do efeito da aeração na FES; Realização da cinética da respiração celular em coluna de Raimbault (Produção de CO2 e consumo de O2); Modelagem matemática de estimação de crescimento da biomassa por modelo de correlação. Metodologia: Caracterização do substrato (bagaço de malte) quanto à sua composição centesimal (fibras, lipídeos, proteínas, umidade, cinzas, carboidratos e energia); Contagem de esporos do fungo Aspergillus niger por microscópio e lamina de Neubauer; Planejamento experimental com o delineamento composto central rotacional com três fatores (umidade, tempo de fermentação e proporção do substrato/suporte) e resposta de atividade enzimática; Determinação da atividade enzimática pelo método do DNS; Determinação da condição ótima de fermentação em frascos pelo software Statistica 7.0 e avaliação do modelo estatístico (teste anova e falta de ajuste); Validação do modelo matemático estatístico com experimento no ponto ótimo e cinética de atividade enzimática; Avaliação da cinética de hidrólise do amido em 5, 10, 15, 20, 25 e 30 min do ponto ótimo; Montagem das colunas de Raimbault com o sistema de banho maria e com aeração por compressor de ar; Fermentação em estado sólido com influência da aeração do meio pela coluna de Raimbaul com variação da aeração do meio; Cinética de atividade enzimática em 5 dias de fermentação na coluna, com intervalo de dia em dia; Montagem e adaptação do equipamento de medição de CO2; Medição das concentrações CO2 de entrada e saída das fermentações em coluna; Modelagem matemática de estimação de crescimento da biomassa pelas variações do modelo de Luedeking e Piret; Resultados esperados: Encontrar um modelo que represente bem e o ponto ótimo do cultivo dentro da região escolhida para a FES; Apresentar a cinética de estudo da produção do complexo enzimático amilolítico, para interpretação dos dados; Conseguir determinar o tempo ideal de hidrólise do amido; Espera-se encontrar dados satisfatórios de produção do complexo enzimático para as colunas de Raimbault, além de avaliar positivamente o efeito da aeração no meio; Conseguir determinar com eficiência as concentrações em tempo real da respiração celular, através do equipamento de medição on-line; Determinar um modelo de correlação dentro dos analisados que estime bem o crescimento da biomassa nas colunas.
The objective of the present work was to present an alternative for the production of α-amylase enzymes by Aspergillus niger fungus through solid-state fermentation. The solid residue of the brewing industry, the brewer’s spent grain, was used as the fermentation substrate combined with an inert support of sugarcane bagasse. In order to characterize the fermentation substrate, analyzes of water, protein, lipids, carbohydrates, ashes and phosphorus, calcium, magnesium and potassium were realized. For the solid-state fermentation, a study was performed using an experimental of Central Composite Rotational Design (CCRD) in order to determine the best conditions of the enzymatic activity varying the solid matrix moisture (60 to 85%), the time (48 to 168 hours) and the percentage of substrate in the solid matrix (50 to 90%). Fermentation kinetics were performed to validate the values obtained by the experimental design. The effect of pH on the enzymatic activity was evaluated by extracting the enzyme complex in the pH range between 4.0 and 9.0, besides evaluating the stability of the enzyme with storage time of 24 and 48 hours after the extraction. The hydrolysis of the soluble starch was optimized by the action of the enzymes extracted by the DCCR method, varying the temperature factors (50 to 80 ºC) and the hydrolysis time (5 to 30 min). The characterization of the solid residue composition of the brewing industry presented a protein content of 16.13 ± 0.15 % and carbohydrate contents of 70.58 ± 0.97 %, qualifying as a promising residue with excellent sources of substrates for fermentation in solid state. The kinetics of amide hydrolysis by α-amylase were performed at different concentrations of substrate (0, 5, 7.5, 10, 20, 30, 40 and 50 g/L) to determine the Michaelis-Menten constant (Km) and the maximum speed (Vmax). The optimal conditions for solid state fermentation were 80% moisture, 102.1 hours fermentation and 85.9% substrate, obtaining 618.20 U/gMS. The optimum data for α-amylase production were validated, obtaining a value of 622.25 ± 33.76 U/gMS. The pHs of 4.0 and 4.5 presented higher activity with values of 1454.9-1421.2 U/gMS, respectively. After storage for 24 hours and 48 hours α-amylase activities reduced on average 4.57% and 10.43%, respectively. In the α-amylase hydrolysis process, the temperature and time variables had optimal conditions of 68 °C and 5 min, respectively, with a maximum enzymatic activity of 2699.22 U/gMS. The values of Km = 5.60 g/L and Vmax = 1.216 μmol/mL/min were determined by enzymatic kinetics.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/11029
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