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Título: Efeitos in vitro da triiodotironina na diferenciação condrogênica das células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratas
Autor(es): Assis, Higor Azevedo
Orientador: Boeloni, Jankerle Neves
Coorientador: Careta, Francisco de Paula
Palavras-chave: Diferenciação condrogênica
Hormônio tireoidiano
Medula óssea
Thyroid hormone
Bone marrow
Chondrogenic differentiation
Data do documento: 20-Fev-2017
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: Os hormônios tireoidianos influenciam in vivo o crescimento ósseo, pois regulam os processos de diferenciação e maturação dos condrócitos da zona hipertróficada placa epifisária e em culturas de condrócitos e de ATDC cells estimulam a maturação dessas células. Além disso, como tanto as células tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) quanto do tecido adiposo (CTM-TA) podem dar origem aos condrócitos, é provável que essas células respondam à adição de T3 com aumento da diferenciação condrogênica. Assim, o objetivo deste projeto será estudar o efeito in vitro da T3 na diferenciação condrogênica de CTM-MO e de CTM-TA, durante vários períodos e em várias doses. Serão utilizadas seis ratas Wistar com um mês de idade que serão eutanasiadas com sobredose de anestesia e, imediatamente após este procedimento, seus ossos longos (fêmur e tíbia) serão colhidos assepticamente e submetidos à extração da medula óssea para obtenção de um pool de células. Além dos ossos, será colhido assepticamente o tecido adiposo visceral para obtenção de um pool de células. As CTM-MO e as CTM-TA serão cultivadas in vitro em meio de indiferenciação para avaliação da caracterização fenotípica por citometria de fluxo e da viabilidade celular pelo uso da técnica de coloração pelo azul de Tripan. Posteriormente, as células serão cultivadas em meio de diferenciação condrogênico, acrescido ou não de 3,3,5-triiodo-L-tironina (T3), dependendo do grupo. Serão constituídos dez grupos experimentais cultivadas em meio condrogênico: 1) CTM-MO sem T3; 2) CTM-TA sem T3; 3,4,5,6) CTM-MO tratadas com T3 (0,01; 1; 100; 1000nM); 7,8,9,10) CTM-TA tratadas com T3 (0,01; 1; 100; 1000nM). Após sete, 14 e 21 dias de diferenciação serão avaliados: a conversão do substrato dimetiltiazol (MTT) em cristais de formazan, a celularidade, a expressão de Sox-9, Runx-2, Agrecano, colágeno II e colágeno X, Caspase-3 e fosfatase alcalina, por RT-PCR em tempo real e, a análise histomorfométrica das células (formação de matriz cartilaginosa). Será realizado cultivo de condrócitos que serão utilizados como controle positivo da diferenciação condrogênica. Todos os ensaios in vitro, serão realizados com seis repetições em cada grupo e em cada período. Para análise dos resultados, os dados serão submetidos à análise de variância ANOVA e as médias serão comparadas pelo teste de Student-Newman Keuls (SNK). Todos os procedimentos experimentais serão executados segundo as recomendações e a aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Espírito Santo.
Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) are cells with chondrogenic differentiation capacity that have receptors for thyroid hormones. The aim of the present study was to verify the in vitro effect of triiodothyronine (T3) on the chondrogenic differentiation of female rat BMMSCs over several time periods and at several doses. CD54+/CD73+/CD90+ BMMSCs from Wistar female rats were cultured in chondrogenic medium with or without T3 and were separated into five groups: 1) BMMSCs without T3; 2) BMMSCs with 0.01 nM T3; 3) BMMSCs with 1 nM T3; 4) BMMSCs with 100 nM T3; and 5) BMMSCs with 1,000 nM T3. At seven, 14, and 21 days, the cell morphology, chondrogenic matrix formation, and expression of Sox9 and collagen II were evaluated. For the analyses, the Kruskal-Wallis test was used, followed by the Dunn post hoc test or the Student-Newman-Keuls test. The dose of 100 nM did not alter the parameters evaluated in any of the periods studied. However, the 0.01 nM T3 dose improved the chondrogenic potential by increasing the chondrogenic matrix formation and expression of Sox9 and collagen II in at least one of the evaluated periods; the 1 nM T3 dose also improved the chondrogenic potential by increasing the chondrogenic matrix formation and the expression of collagen II in at least one of the evaluated periods. The 1,000 nM T3 dose stimulated early cell hypertrophy but improved the chondrogenic potential by increasing the chondrogenic matrix formation and Sox9 expression in at least one of the evaluated periods. In conclusion, T3 has a dose-dependent effect on the differentiation of BMMSCs from female rats. Here, 0.01 nM T3 was the dose that presented the best effect by increasing the chondrogenic matrix formation and the expression of Sox9 and collagen II in at least one of the evaluated periods.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/7791
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