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Título: Calogênese de pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam.-fabaceae) in vitro visando a obtenção de um banco de germoplasma
Autor(es): Werner, Elias Terra
Orientador: Cuzzuol, Geraldo Rogério Faustini
Coorientador: Milanez, Camilla Rozindo Dias
Data do documento: 27-Fev-2009
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de estudar a calogênese de C. echinata in vitro, pela obtenção de calo, e o controle desse processo, testando-se diferentes meios de cultura, fontes de nitrogênio e interação entre auxinas e citocininas, com a finalidade de regeneração e conservação da espécie. A indução da calogênese é a primeira etapa, em que foram usados discos de foliólulos do pau-brasil em diferentes fases de desenvolvimento (junvenis, jovem e adulto) combinados com 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (0, 5, 10, 20, 50, 100 mg/L) e 6-benzilaminopurina (6-BAP) (2,0 mg/L) cultivados em meio de cultura MS. Foliólulos juvenis cultivados com concentração de 2,4-D de 5 a 20 mg/L e foliólulos jovens tratados com 50 e 100 mg/L 2,4-D geraram calos sem diferenças significativas entre luz e escuro. A transferência de calos do meio MS com 5,0, 10,0 e 20,0 mg/L de 2,4-D para meio sem fitorreguladores estimulou a formação de massas pró-embrionárias (MPEs). Os meios livres de fitorreguladores, 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,5 mg/L de 2,4-D elevou o número de calos embriogênicos e de massas pré-embrionárias. Somente em 0,5 mg/L 2,4-D verificou-se algumas estruturas semelhantes à embriões somáticos na fase globular e codiforme. Testou-se também diferentes antioxidantes (ácido cítrico, ácido ascórbico e carvão ativado) nos foliólulos jovens de pau-brasil, com intuito de controlar a oxidação desses explantes. Os melhores resultados foram proporcionados pelo carvão ativado, porém, inibitório à calogênese. Avaliou ainda a resposta no crescimento de calos de pau-brasil sob influência de diferentes meios de cultura (MS, B5, White e WPM), de fontes nitrogenadas e suas interações (NH4NO3, KNO3 e glutamina) e a interação entre auxinas (2,4-D, AIA e AIB) e citocininas (BAP e KIN). Os explantes utilizados para estes testes foram calos de pau-brasil, induzidos a partir de foliólulos juvenis, inoculados em meio de MS suplementado com 20 mg/L de ácido 2,4-diclorofenóxiacético (2,4-D). Fragmentos de aproximadamente 0,1g de massa fresca foram utilizados para a análise dos diferentes meios de cultura, efeitos dos compostos nitrogenados e a interação de auxinas e citocininas. As análises de massa fresca foram realizadas nos experimentos aos 30 e 60 dias após a inoculação. No final de cada experimento (60 dias) determinou-se a massa seca. Com relação aos meios testados, MS, B5 e White não diferenciaram entre si estatisticamente. No entanto, o meio WPM apresentou valores significativamente diferente em relação aos outros 3 meios (MS, B5, White). Nas fontes de nitrogênio testadas e suas interações, o tratamento tendo como única fonte o NH4NO3 estimulou melhores resultados aos 60 dias de cultivo. A interação entre auxinas e citocininas, de modo geral, não houve diferença estatística entre os tratamentos. No entanto, os tratamentos com 2,4-D foram os que possibilitaram maior produção de massa fresca dos calos sendo a concentração de 0,5 mg/L de 2,4-D associada a 5,0 mg/L BAP proporcionou melhor resultado. Realizou-se análise histológica nos calos, mostrando que não houve a formação de embriões somáticos nos calos de pau-brasil. Porém, verificou-se que a calogênese em pau-brasil ocorre na superfície adaxial dos foliólulos, resultado da proliferação das células do parênquima clorofiliano. Os calos apresentaram coloração variando do amarelo escuro a marrom, mostrando aspecto friável, não embriogênico, e com acúmulo de conteúdo fenólico. Observou-se ainda a presença de áreas meristemáticas (meristemóides), mostrando que calos de pau-brasil são competentes, embora não embriogênicos.
This work was carried out in order to study the callogenesis of C. echinatain vitro, through callus production, and the control of this process, by testing different culture media, sources of nitrogen and interaction between auxins and cytokinins, aiming the regeneration and conservation of the species. The induction of callus is the first step, in which leaf disks of brazilwood were used at different stages of development (juvenile, young and adult) combined with the growth regulators 2,4-D (0, 5, 10, 20, 50, 100 mg/L) and 6-BAP (2.0 mg/L) cultivated in MS culture medium. Juveniles leaves cultivated with low concentration of 2,4-D (5 and 20 mg/L) and young leaves treated with high concentrations of 2,4-D (50 and 100 mg/L) produced callus without significant differences between light and dark. The transfer of callus from MS culture medium with high concentrations of 2,4-D (5.0, 10.0 and 20.0 mg/L) to medium without growth regulators stimulated the formation of pro-embryonic masses (PEMs). Media free of growth regulators, 2.0 mg/L 2,4-D and 0.5 mg/L 2,4-D increased the number of embryogenic callus and pre-embryonic masses. Only on 0.5 mg/L 2,4-D structures similar to somatic embryos in globular stage and codiforme were observed. Different antioxidants were also tested (citric acid, ascorbic acid and activated charcoal) on young leaves of brazilwood in order to control the oxidation of the explants. The best results were provided by activated charcoal, however, inhibitory to callus. Response in growth of calluses of brazilwood was evaluated under the influence of different culture media (MS, B5, WPM and White), of different nitrogen sources and their interactions (NH4NO3, KNO3 and glutamine) and the interaction between auxins (2,4-D, IAA and IBA) and cytokinins (BAP and KIN). The explants used for these tests were callus of brazilwood, induced from juveniles leaves, inoculated in MS medium supplemented with 20 mg/L of 2,4-D. Fragments of approximately 0.1 g of fresh weight were used for the analysis of different culture media, effects of nitrogen compounds and the interaction of auxins and cytokinins. The analysis of fresh weight, on the experiments, were performed at 30 and 60 days after inoculation. At the end of each experiment (60 days) dry weight was determined. Regarding the media tested, MS, B5 and White did not differ statistically. However, the WPM media showed significantly different values compared to the other 3 media (MS, B5, White). A for the sources of nitrogen tested and their interactions, the treatment with a single source, NH4NO3, stimulated the best results after 60 days in culture. The interaction between auxins and cytokinin, in general, did not present statistical difference between treatments. However, treatments containing 2,4-D were the ones who produced callus with the highest fresh weight, in wich the concentration of 170.5 mg/L 2,4-D combined with 5.0 mg/L BAP gave better results. Histological analysis were carried out on callus, indicating that the formation of somatic embryos occured in callus of brazilwood. However, it was found that the callogenesis in brazilwood occurs on the adaxial surface of the leaf, as a result of proliferation of parenchymal cells. The callus showed colors ranging from dark yellow to brown, showing a friable aspect, not embryogenic, and accumulation of phenolic content. It was also observed the presence of meristematic areas (meristemoids), showing that callus of brazilwood were competent, but not embryogenic
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/9979
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