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Título: Uso da citometria de fluxo para avaliar os efeitos da alta pressão hidrostática em Saccharomyces cerevisiae
Autor(es): Nati, Tassia
Orientador: Fernandes, Patricia Machado Bueno
Coorientador: Fernandes, Antonio Alberto Ribeiro
Data do documento: 24-Fev-2014
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Citação: NATI, Tassia. Uso da citometria de fluxo para avaliar os efeitos da alta pressão hidrostática em Saccharomyces cerevisiae. 2014. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, 2014.
Resumo: O objetivo principal desse trabalho foi analisar os efeitos da alta pressão hidrostática (HHP) à membrana citoplasmática de leveduras, através da utilização da técnica decitometria de fluxo. Células de Saccharomyces cerevisiae Y440 Mat a, leu2 tiveram seu crescimento e viabilidade celular avaliados por citometria de fluxo. Após submetidas a pressões de 50, 100, 150 e 200 MPa analisou-se as características morfológicas das células. Os danos causados à membrana citoplasmática foram observados através do uso dos corantes Brometo de Etídio, Bis-Oxonol e Iodeto de Propídio. Os resultados encontrados mostram que a Citometria de Fluxo baseada em dados óticos de espalhamento de luz pode ser utilizada como uma técnica relativa de contagem de células, mas não como uma técnica absoluta, devido à presença dos brotamentos. Os corantes SYTO 9 e Alexafluor conjugado à Concanavalina não foram adequados para a discriminar as duas subpopulações formadas por células com e células sem brotamento. Os fluoróforos SYTO 9 e Iodeto de Propídio se mostraram apropriados para a análise de viabilidade celular, mostrando forte correlação com a técnica de plaqueamento. As pressões de 150 e 200 MPa causaram redução no tamanho celular das leveduras S. cerevisiae. Esses resultados são explicados pelos efeitos conhecidos da HHP às células, como a repressão da síntese de biomassa, maior empacotamento dos lipídios da membrana citoplasmática e interrupção do ciclo celular. Foi observado também redução na complexidade celular de S. cerevisiae. Estes resultados são atribuídos à degradação dos componentes internos das leveduras, gerada pela aplicação de pressões hidrostáticas letais. Quanto à fisiologia celular notou-se, a partir de 150 MPa, um aumento significativo dos danos causados pela HHP. A técnica BEBOXPI, não foi capaz de detectar células no estágio inicial de estresse, na qual as bombas citoplasmáticas se tornam inativas. A análise de fisiologia celular realizada apenas com os fluoróforos BOX e PI quando comparada aos resultados obtidos com o kit live/dead mostrou excelentes resultados. Ambas as técnicas forneceram dados iguais de porcentagem de células mortas, tanto nas amostras controle quanto nas amostras tratadas. Quanto às células vivas, enquanto o Live/dead detectou apenas a viabilidade das células, o BOXPI dividiu os dados referentes às células vivas em duas subpopulações: vivas/saudáveis e vivas/estressadas. Assim, foi possível através da citometria de fluxo obter dados mais aprofundados sobre os danos causados pela HHP, principalmente os referentes a despolarização da membrana citoplasmática.
The main objective of this study was to analyze the high hydrostatic pressure effects in yeast cells by flow cytometry. Saccharomyces cerevisiae Y440 Mat a, leu2 cells had their growth and cell viability assessed by flow cytometry. The cells were subjected to high hydrostatic pressure and their morphological characteristics were analyzed. Changes in cell physiology were observed by using Ethidium Bromide (BE), Bis-oxonol (BOX) and Propidium Iodide (PI). The results show that flow cytometry based on optical data from the light scattering can be used as a relative counting technique, but not as an absolute technique due to the presence of budding cells. SYTO 9 and PI fluorophores were suitable for analyze cell viability, showing strong correlation with the plating technique. High hydrostatic pressure caused cell size and cell complexity reduction
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/4482
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