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Título: Relação genética e potencial de virulência de isolados de Escherichia coli enteroagregativa de crianças de comunidades quilombolas
Autor(es): Guerrieri, Caroline Gastaldi
Orientador: Spano, Liliana Cruz
Coorientador: Schuenck, Ricardo Pinto
Data do documento: 22-Fev-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Citação: GUERRIERI, Caroline Gastaldi. Relação genética e potencial de virulência de isolados de Escherichia coli enteroagregativa de crianças de comunidades quilombolas. 2018. 103 f. Dissertação (Mestrado em Doenças Infecciosas) - Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, 2018.
Resumo: Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patotipo emergente responsável por diarreia aguda e persistente, caracterizado por marcante heterogeneidade quanto aos potenciais fatores de virulência entre os isolados. EAEC pode ser classificada em típica (tEAEC) e atípica (aEAEC) com base na presença do regulon AggR, sugerindo-se uma maior virulência para tEAEC, embora aEAEC esteja relacionada a surtos de diarreia. Tivemos como objetivo determinar a relação genética e o potencial de virulência in vivo de isolados de tEAEC e aEAEC de crianças de comunidades quilombolas. Para análise da heterogeneidade clonal, empregamos a técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) após digestão com enzima de restrição XbaI em 73 amostras previamente caracterizadas quanto ao repertório de genes de virulência. A virulência de 20 amostras de EAEC (10 tEAEC e 10 aEAEC) além de cepas referência de tEAEC (EAEC 042), aEAEC (C1096) e E. coli não patogênica HB101 foi investigada em modelo de Galleria mellonella. Foi analisada a sobrevivência das larvas após inoculação de 104 a 107 UFC/larva e determinada a carga bacteriana da hemolinfa após inoculação de 105 UFC/larva das cepas referência, em diferentes períodos após infecção. Além disso, avaliamos características fenotípicas de virulência de 10 amostras de EAEC, (produção de enzimas, sideróforos e de biofilme). Para análise epidemiológica a nível global, 10 isolados foram submetidos à tipagem molecular pela técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). Evidenciamos 58 pulsotipos distintos e sem relação com o perfil de genes de virulência e a comunidade de origem, para a maior parte das amostras. No modelo de G. mellonella, observamos que: (i) mortalidade das larvas foi dependente da concentração inoculada de tEAEC e aEAEC; (ii) cepas e amostras de aEAEC foram tão virulentas quanto de tEAEC, porém, a virulência média foi maior para as tEAEC; (iii) Não houve relação entre número de genes de virulência e a virulência no modelo; (iv) em contraposição às cepas EAEC 042 e EAEC C1096, a cepa E. coli HB101 não provoca melanização e é eliminada da hemolinfa com 2 horas após infecção. Em relação às características fenotípicas de virulência: (i) nenhuma amostra produziu fosfolipase, protease ou esterase; (ii) apenas uma amostra produziu hemolisina; (iii) todas as amostras analisadas produziram sideróforos; (iv) somente uma amostra não produziu biofilme. As 10 amostras analisadas pelo MLST pertencem a STs distintos e, portanto, representam diferentes linhagens evolutivas. Os STs: 443, 730, 1178, 1286 e 2481, detectados nas nossas amostras, não haviam sido descritos para EAEC até o momento. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram uma alta heterogeneidade de EAEC nas comunidades quilombolas mesmo estas sendo semi-isoladas, visto que a maior parte das amostras não apresentou relação genotípica entre si. Além disso, novos STs foram observados em amostras de EAEC e ao contrário do que se sugere na literatura, pelo modelo de estudo, as aEAEC podem ser tão virulentas quanto as tEAEC.
Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an emerging pathotype responsible for acute and persistent diarrhea. It is characterized by high heterogeneity of the potential virulence factors among the isolates. EAEC can be classified as typical (tEAEC) and atypical (aEAEC) based on the presence of the AggR regulon, suggesting a higher virulence for tEAEC, although the aEAEC is related to outbreaks of diarrhea. We aimed to determine the genetic relationship and in vivo virulence potential of tEAEC and aEAEC isolates from children of quilombola communities. To analyze the clonal diversity, we used the electrophoresis pulsed field gel electrophoresis (PFGE) after digestion with XbaI restriction enzyme in 73 strains previously characterized according to the repertoire of virulence genes. The virulence of 20 EAEC strains (10 tEAEC and 10 aEAEC) in addition to reference strains of tEAEC (EAEC 042), aEAEC (C1096) and non-pathogenic E. coli HB101 was investigated with Galleria mellonella model. The survival of the larvae was analyzed after inoculation of 104 to 107 CFU/larvae and the bacterial load in the hemolymph was determined after inoculation of 105 CFU/larvae of the reference strains, at different periods after infection. In addition, we evaluated phenotypic characteristics of virulence of 10 EAEC isolates (enzyme, siderophores and biofilm production). For epidemiological analysis at the global level, 10 isolates were submitted to molecular typing using the Multilocus Sequence Typing (MLST). We observed 58 distinct pulsotypes, with no relationship between the virulence gene profile and the community of origin, for most of the strains. Concerning G. mellonella model, we observe: (i) mortality of the larvae was dependent on the inoculated concentration of tEAEC and aEAEC; (ii) strains of aEAEC were as virulent as those of tEAEC, but the mean virulence was higher for tEAEC; (iii) There was no relationship between the number of virulence genes and the in vivo virulence; (iv) in contrast to EAEC 042 and EAEC C1096, E. coli HB101 does not cause melanization and is eliminated from the haemolymph at 2 hours post infection. Regarding the phenotypic characteristics of virulence: (i) no strain produced phospholipase, protease or esterase; (ii) only one strain produced haemolysin; (iii) all analyzed strains produced siderophores; (iv) only one strain did not produce biofilm. The 10 isolates analyzed by MLST belong to distinct STs and, therefore, represent different evolutionary lineages. The STs: 443, 730, 1178, 1286 and 2481, detected in our strains, had not been described for EAEC to date. In conclusion, the results obtained demonstrate a high heterogeneity of EAEC from quilombola communities, even though they are semi-isolated, since most of the strains had no genotypic relationship between them. In addition, new STs were observed in EAEC strains and, in contrast to what is suggested in the literature, in the model of the study, aEAEC may be as virulent as tEAEC.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/7156
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